utilisation des approches ADNe diatomées (métabarcoding) comme outils de biomonitoring
Le « métabarcoding » est une technique qui permet d’identifier l’ensemble des espèces retrouvées dans un échantillon environnemental (ex : prélèvement de diatomées) sur la base de courts fragments d’ADN appelés « barcodes ». Cette approche est particulièrement bien adaptée à l’étude des communautés benthiques de diatomées présentes dans les milieux aquatiques (cours d’eau et lac) et repose sur plusieurs étapes :
- Echantillonnage: Le protocole de prélèvement suit les recommandations du rapport technique FD CEN/TR 17245 (Décembre 2018). L’échantillonnage des diatomées benthiques est réalisé en collectant les biofilms aquatiques (périphyton) sur plusieurs substrats solides immergés (pierre). De l’éthanol est ensuite ajouté afin de préserver les échantillons
- Extraction de l’ADN total : les biofilms aquatiques étant riches en matière organique et acides humiques pouvant interférer avec les méthodes de biologie moléculaire, il est important d’utiliser une méthode d’extraction de l’ADN adaptée. Plusieurs protocoles peuvent être mis en place pour extraire l’ADN total du biofilm, ou des kits commerciaux peuvent être utilisés (Vasselon et al. 2017a).
- Amplification du « barcode » par PCR : une courte région d’un gène (rbcL), codant pour une enzyme intervenant dans la photosynthèse, est utilisée comme barcode et amplifiée par PCR (Polymerase Chain Reaction). Le produit ainsi issu de la PCR est majoritairement composé de barcode rbcL de diatomées.
- Séquençage : le produit PCR est ensuite préparé en laboratoire afin de permettre le séquençage (= détermination de l’enchainement des nucléotides) de l’ensemble des barcodes contenus dans l’échantillon. Les technologies de séquençage à haut-débit (HTS) sont utilisées car elles présentent l’avantage de pouvoir obtenir plusieurs millions de séquences en un seul run d’analyse, permettant ainsi le séquençage en parallèle de plusieurs centaines d’échantillons.
- Traitement bioinformatique: les données brutes de séquençage, correspondant aux fichiers informatiques contenant toutes les séquences ADN, doivent subir différents traitements bioinformatiques. Ces traitements ont pour objectif de nettoyer les séquences afin d’enlever le bruit de fond apporté par de potentiels biais méthodologiques, tout en permettant de conserver les séquences de diatomées qui ont un sens biologique. Bien que de nombreux logiciels de bioinformatique (Mothur, R) soient disponibles et permettent de traiter la donnée de manière semi-automatique, une expertise reste indispensable afin d’adapter les traitements en fonction des méthodes de biologie moléculaire employées et des questions écologique posées.
- Base de référence de barcodes : afin d’identifier les diatomées présentes dans l’échantillon, il est nécessaire de confronter les barcodes environnementaux à une base de référence de barcodes. Cette base est généralement conçue à partir de cultures pures de diatomées pour lesquelles la taxonomie est connue et une séquence ADN servant de barcode de référence est disponible. La base « Diat.barcode », développée à l’INRA en collaboration avec 6 autres équipes étrangères, sert de base de barcodes rbcL pour les diatomées : https://www6.inra.fr/carrtel-collection/Barcoding-database/
Une fois l’ensemble de ces étapes réalisées, il est possible d’obtenir un inventaire taxonomique moléculaire des diatomées retrouvées dans l’échantillon étudié.
Utilisation pour le biomonitoring
Au cours des dernières années, de nombreux développements méthodologiques ont été réalisés afin de permettre une optimisation du métabarcoding ADN des diatomées (Vasselon et al. 2019). La fiabilisation des inventaires taxonomiques, d’un point de vue qualitatif et quantitatif, rend possible l’utilisation de cette approche pour le biomonitoring des milieux aquatiques. Bien que cette approche innovante ait le potentiel pour répondre à des questions de gestion, son application opérationnelle reste délicate et nécessite un appui technique et scientifique approprié. SCIMABIO Interface, en tant que spécialiste du transfert de technologies entre science et gestion, propose son expertise et son savoir-faire dans ce nouveau domaine.
- L’élaboration de designs expérimentaux en amont du projet afin de définir la bonne stratégie d’échantillonnage des biofilms aquatiques ;
- L’organisation et la prise en charge des différentes étapes du processus, depuis l’échantillonnage jusqu’à l’analyse des données, en incluant les différentes étapes de biologie moléculaire (extraction ADN, PCR, séquençage) ;
- La réalisation des traitements bio-informatiques adaptés et personnalisés pour répondre aux attentes du projet ;
- L’organisation, la validation et le traitement statistique des données.
Bien que le métabarcoding des diatomées puisse être utilisé pour évaluer l’état écologique des cours d’eau en produisant des notes de qualité (type IBD [NF T90-354, avril 2016], IPS ; Cemagref 1982), l’absence de cadrage réglementaire ne permet pas encore d’utiliser cette approche dans le cadre des suivis annuels DCE. Cette approche peut toutefois être employée en parallèle de l’approche morphologique et ainsi apporter une plus-value aux suivis réalisés.
Références :
Cemagref. (1982). Étude des méthodes biologiques quantitative d’appréciation de la qualité des eaux. Bassin Rhône-Méditerranée-Corse. Centre National Du Machinisme Agricole, Du Génie Rural, Des Eaux et Des Forêts, Lyon, France.
FD CEN/TR 17245 (T90-878). Décembre 2018. Qualité de l’eau – Rapport technique pour l’échantillonnage en routine de diatomées benthiques dans les rivières et les plans d’eau adapté pour les analyses en metabarcoding
NF T90-354 (Avril 2016). Qualité de l’eau – Échantillonnage, traitement et analyse de diatomées benthiques en cours d’eau et canaux
Vasselon, V., Domaizon, I., Rimet, F., Kahlert, M., & Bouchez, A. (2017). Application of high-throughput sequencing (HTS) metabarcoding to diatom biomonitoring: Do DNA extraction methods matter? Freshwater Science, 36(1), 162–177. doi:10.1086/690649
Vasselon, V., Rimet, F., Domaizon, I., Monnier, O., Reyjol, Y., & Bouchez, A. (2019). Évaluer la pollution des milieux aquatiques avec l’ADN des diatomées : où en sommes-nous ? Techniques Sciences Méthodes, (5), 53–70. doi:10.1051/tsm/201905053